Inzicht in cuvetvolume, materiaal, padlengte enz.
Een spectrofotometer is een ideale keuze voor het meten van licht van belang zijnde materialen absorptie of doorlaatbaarheid op een specifieke golflengte van het spectrum, om op deze manier gegevens over de stof te krijgen concentratie en puurheid Een cuvet is een klein vat met monsters die worden gebruikt voor spectroscopische metingen en die in de spectrofotometers worden geplaatst. Cuvetten zijn gemaakt van verschillende maten volumes, en materialen , en zou moeten zijn transparant voor het beoogde golflengtebereik.
Soorten cuvetten
Voor de fotometrische metingen van vloeibare oplossingen moeten de monsters in een vooraf bepaald formaat in het optische lichtpad van een fotometer (spectrofotometer, fluorometer of colorimeter) worden geplaatst. De standaardoptie voor deze toepassing zijn cuvetten, monstercontainers met 2 of 4 optische doorzichtige vensters.
Figuur 1. Standaard optische padlengte van cuvetten
Er zijn zoveel soorten cuvetten beschikbaar (we hebben meer dan 260 stuks cuvetten vermeld op onze sites), zelfs als we het bereik beperken tot alleen die welke worden gebruikt voor absorptiemetingen op het gebied van UV-vis-spectrofotometrie.
Verschillende cuvetteschema’s, a – e zijn standaardgroottecellen
Voorbeeldoplossing is ondergebracht binnen de rlijnen van de cuvetten hierboven. Cuvetcellen a – e worden getekend met externe afmetingen van 12,5 x 12,5 x 45 mm.
- a: 10 x 10 mm fluorescentiecuvet binnenmaat;
- b: 2 x 10 mm semi-microfluorescentiecuvet;
- c: 2 x 10 mm semi-micro-absorptiecuvet;
- d: 2 x 10 mm sub-microvolume cuvet;
- e: 2 x 2 mm fluorescentiecuvet binnenmaat.
Fluorescentiecuvetten zijn cuvetten die 4 heldere wanden hebben (sommige gespecialiseerde soorten cuvetten hebben drie transparante wanden), terwijl absorptiecuvetten meestal 2 wanden helder zijn. Cuvetten f en g zijn voorbeelden van cuvetten met een niet-standaardafmeting, die ook cuvetten met een korte weglengte worden genoemd. De padlengte en uitwendige afmeting zijn kleiner dan bij standaard cuvetten.
De weglengte van de cuvet is de lengte van het licht dat door de cuvet gaat.
Cuvetten a en c hebben een weglengte van 10 mm. Cuvetcellen b, c en f hebben dezelfde binnenafmetingen (2 x 10 mm) en cuvetten e en g hebben dezelfde binnenafmetingen (2 x 2 mm) maar verschillende buitenafmetingen.
OPMERKING: Cuvetten f en g buitenafmetingen zijn niet standaard en zijn in deze bespreking niet van toepassing, tenzij er specifiek naar wordt verwezen. Desalniettemin kunnen degenen die vertrouwd zijn met niet-standaard cuvetten deze altijd gebruiken met behulp van geschikte adapters of speciaal ontworpen monsterhouders.
Cuvette c is een semi-microvolume-absorptiekuvet (2 heldere wanden). Het heeft twee donkere (zwarte) muren die geen licht doorlaat. Dit is handig omdat een cuvet met een weglengte van 10 mm kan worden gebruikt met een veel kleiner volume en licht dat niet door de oplossing gaat, wordt gemaskeerd zodat het niet naar de lichtdetector reikt.
Het is erg belangrijk om cuvette b niet te gebruiken in plaats van cuvette c in een absorptie-experiment. Door b in de absorptiemeting te gebruiken, leidt dit tot een onjuiste aflezing, zelfs als de achtergrond van de cuvet b is gemeten. Cuvette c daarentegen is niet geschikt voor een emissiemeting, die meestal met een andere geometrie wordt uitgevoerd.
De factoren zoals monstereigenschappen, beschikbaarheid van het volume, concentratieniveaus en soorten metingen die moeten worden uitgevoerd, moeten van invloed zijn op de beslissing bij het kiezen van de juiste cuvet voor uw toepassingen.
Figuur 2. Verschillende soorten cuvetten
Cuvetten op volume
De meest gebruikte cuvet is van het vierkante type met een uitwendige afmeting van 12,5 x 12,5 mm en een hoogte van 45 mm en een binnenmaat van 10 x 10 mm. Dit is een standaardafmeting waarvoor de meeste spectrofotometers en fluorometerhouders zijn ontworpen. M.Alle soorten grotere en kleinere cuvetten zijn natuurlijk ook beschikbaar. Er zijn ook adapters verkrijgbaar waarmee kleinere cuvetten met een korte padlengte in de standaardhouder kunnen worden geplaatst die vierkante cuvetten van 12,5 mm x 12,5 mm accepteert.
Met deze externe maat zijn de cuvetten verkrijgbaar bij< 100 microliter ( sub-micro-cuvetten ) tot een paar honderd microliter ( semi-micro-cuvetten ) naar cuvetten met standaardvolume van 3,5 milliliter. Natuurlijk, een groter volume cuvetten (macrotype ) groter dan 3,5 ml is ook beschikbaar, en de externe maat zal groter zijn.
Figuur 3. Cuvetten verschillen in volume met dezelfde voetafdruk
Hoe wordt het cuvetvolume bepaald?
Het volume van de cuvet verwijst ook naar het vloeistofmonstervolume waarvoor ze zijn ontworpen.
Een vierkante cuvet van 1 cm biedt plaats aan 1 ml vloeistof per cm hoogte. Daarom kan een cuvet met een hoogte van 43,75 mm (45 mm – 1,25 mm basisdikte) tot 4,375 ml vloeistof bevatten. Als de cuvet voor 80% vol is, is het totale volume 3,5 ml, het zogenaamde standaard volume
4,375 ml x 80% = 3,5 ml
De reden voor 80% is dat u de cuvet nooit voor meer dan 80% moet vullen. Als de vloeistoffen te dicht bij de rand van de cel zijn (> 80%), kunnen ze gemakkelijk morsen en zullen ze tijdens de metingen veel problemen veroorzaken.
Wat zijn de opties voor het cuvetvolume?
Er zijn vier soorten volume-opties beschikbaar bij het kiezen van een cuvet:
- Het meetvolume van een macro cuvet is groter dan 3,5 ml (7 – 35 ml).
- Een standaardvolume cuvet heeft een meetvolume van 3,5 ml.
- Een semi-microcuvetvolume bevat monsters van 0,35 ml – 1,7 ml. Van deze typen cuvetten met korte weglengte kan een cuvet nodig zijn mounts of afstandhouders
- Een sub-microvolume cuvet kan monsters tussen 20 uL en 350 uL bevatten.
Figuur 4. Macrocuvetten
Figuur 5. Standaard cuvetten van 3,5 ml
Wat is het Keuze uit microvolume cuvetten voor beperkte monsters?
Voor veel biologische metingen zijn de monsters zo waardevol en zijn enkele milliliter van het volume moeilijk te richten. Het benodigde volume kan worden verkleind door twee of vier zijden van de cuvette binnenwanden dikker te maken.
Een cuvet van 4 mm is bijvoorbeeld een cuvet met een uitwendige maat van 12,5 mm x 12,5 mm en een inwendige maat van 4 mm x 10 mm. Zo’n 4 mm cuvet vereist een vloeistofvolume van 1,4 ml per – 45 mm hoogte; Evenzo komt een cuvet van 1 mm overeen met een vloeistofvolume van 0,35 ml per – 45 mm cuvethoogte.
Zie onderstaande voorbeelden:
Figuur 6. Semi-microcuvetten met vierkante bases van 12,5 * 12,5 mm
Figuur 7. Montage en afstandsstuk waardoor cuvetten met korte padlengte in standaardhouder kunnen worden geplaatst
Spectrofotometers en fluorometers nemen metingen op een van de drie standaard optische bundels Z-afmetingen (de afstand van de onderkant van de cuvet tot het midden van de meetopening) – ofwel 8,5, 15 of 20 mm – afhankelijk van het specifieke instrument.
Standaard cuvetten zijn meestal rechtwandig en passen in de meeste spectrofotometers. Aan de andere kant, semi-microcuvetten hebben dezelfde externe voetafdruk, maar hun binnenkant loopt meestal taps toe tot een beperkt aantal monsters. Hoe dan ook, de sub micro-cuvet is ontworpen om door het monster te meten op een specifieke Z-afmeting in de kamer. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de cuvet die u selecteert voor uw monstermetingen, compatibel is met de Z-afmetinghoogte van uw instrument.
Figuur 8. Sub-microvolumecuvetten verschillen in Z-afmetingen
Cuvet op padlengte
In een typisch onderzoekslaboratorium heeft de spectrofotometer een standaard kamerafmeting waarin een cuvet is ondergebracht om een specifieke lichtgolflengte door de monsteroplossing te laten passeren. Deze afstand tussen de parallelle optische vensters van de cuvette is nauwkeurig vervaardigd en vooraf bekend, wat bekend staat als de cuvet pad lengte
Figuur 9. Lengte cuvettetraject
De standaard padlengte van een cuvet is 10 mm, maar een kortere padlengte en langere padlengte is ook uit voorraad leverbaar. Kuvetten met een kortere padlengte hebben meestal een kleiner volume en een langere cuvetpadlengte zorgt voor een groter volume van de cuvet.
Hier zijn enkele belangrijke kenmerken van cuvetten om te overwegen:
- Bij het nemen van steekproeven die bij lage concentraties worden aangetroffen – bijvoorbeeld RNA, enkelstrengs DNA en oligonucleotiden – wordt aanbevolen een padlengte die lang genoeg is om de gegevensuitlezingen binnen het lineaire meetbereik van het instrument te laten vallen. De standaard maat is 10 mm padlengte, het goede nieuws is dat cuvetten met een optionele padlengte nu bij ons verkrijgbaar zijn (dubbele padlengte
Figuur 10. Cuvet van 10 mm die 90 graden kan worden gedraaid voor een aflezing bij een padlengte van 2/5 mm
- Het meten van een monster met een klein volume over een korte padlengte is gemakkelijker en sneller dan het nemen van meerdere stappen om een monster te verdunnen. Omdat er minder pipetteerstappen nodig zijn, zijn de metingen waarschijnlijk ook betrouwbaarder en nauwkeuriger.
- Semi-microvolume cuvetten met een kortere padlengte kunnen werken met cuvette-afstandhouders of -steunen. Deze testresultaten met korte-padcuvetten zijn nauwkeuriger en betrouwbaarder bij het meten van geconcentreerde monsters zoals nucleïnezuren of eiwitten in vergelijking met het verdunnen van monsterpreparaten.
Figuur 11. Cuvetten met korte padlengte en montage
Verder lezen: Selectie UV / VIS-cuvette: Cuvetmateriaal en padlengte
Cuvette door materialen
Cuvetten gemaakt van verschillende materialen passen in verschillende spectrale bereiken. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de geselecteerde cuvette transparant is voor de specifieke golflengten bij het meten van de monsters van belang. Een ideale cuvetmateriaalkeuze zou ook alleen geschikt zijn voor monsters (meestal vloeibare oplossingen) en heeft geen interactie met de monsters gebruikt bij de meting.
Cuvetten hebben een lichttransmissie van a beperkt golflengtebereik , en hebben refractief index diëlektrische mismatch (verschillende brekingsindex van lucht en oplossingen), en kan hebben schade zoals krassen die heel klein en onopgemerkt kunnen zijn. Al deze factoren kunnen van invloed zijn op de uitkomst van de meting van het experiment.
De golflengten van de te gebruiken cuvet worden bepaald door het cuvetmateriaal. Een voldoende transmissie is belangrijk voor de cuvet zodat lichtverzwakking naar de celtransparante wanden geen negatief effect zal hebben op het meetresultaat.
De transmissie voor alle golflengten is niet uniform voor standaard optische cuvetten, en meestal de spectrale transmissie in de UV of IR is het grensbereik. Het zichtbare bereik wordt gewoonlijk overgedragen door bijna alle cuvette-materiaalsoorten.
Er is echter GEEN universele overeenkomst van de minimale transmissie vereist voor een specifiek golflengtebereik. En verschillende normen worden toegepast door verschillende fabrikanten (varieert tussen 10% en 90%).
Bruikbaar transmissiebereik van verschillend materiaal
| Materiaal | Zendbereik |
| Verre UV-kwarts | 170 – 2700 nm |
| Nabij IR-kwarts | 250 – 3500 nm |
| UV-kwarts | 220 – 2500 nm |
| Optisch glas | 340 – 2500 nm |
| Plastic | 380 – 850 nm |
| UV-kunststof | 220 – 900 nm |
Deze tabel mag niet letterlijk als referentie worden opgevat of gebruikt. Het wordt alleen gebruikt om de lezer te laten begrijpen dat het bruikbare bereik van cuvetten aanzienlijk zal variëren. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de te gebruiken cuvette werkt binnen het gewenste golflengtebereik.
Kwarts materiaal heeft de hoogste transmissie- en temperatuurbestendigheid, is vooral transparant in zowel het zichtbare licht als het UV-bereik en is een geschikte keuze bij het meten van monsters in het UV-lichtspectrum.
Glas en plastic materialen zijn normaal transparant voor zichtbaar licht (380-700 nm) maar absorberen in de UV (190 – 340 nm) golflengtebereiken. Daarom zijn glazen en plastic cuvetten ideaal voor colorimetrische eiwitassays of meting van de bacteriële kweekdichtheid, die kan niet worden gebruikt voor concentratie- en zuiverheidsmetingen van monsters in het UV-bereik. Plastic cuvetten zijn goedkoop en kunnen worden weggegooid.
Plastic cuvetten werken onder 380 nm zijn beschikbaar, maar de rest van de meeste doorzichtige plastic cuvetten zijn dat wel ongeschikt voor fluorescentie- of absorptie-experimenten.
In feite leidt het fabricageproces (oppervlaktekwaliteit en wandzuiverheid) tot lichtverzwakking (de absorptiesnelheid). Daarom kunnen de prestaties van de cuvet verschillen van merk tot merk. Bovendien gebruiken veel fabrikanten hun eigen gepatenteerde materialen en oppervlaktecoating om hun transmissiebereik te vergroten en / of hun cuvetkosten te verlagen.
Opmerking: Een hoge transmissie kan nodig zijn om zinvolle en betrouwbare resultaten te produceren, wat problemen kan veroorzaken aan de randen van het transmissiebereik van de cuvette.
Er zijn voor- en nadelen aan de soorten cuvetten. Hier zijn nog enkele tips om u te begeleiden bij het selecteren van de meer geschikte cuvet voor nauwkeurige en betrouwbare monstermetingen.
Verder lezen: Selectie UV / VIS-cuvette: Cuvetmateriaal en padlengte
Hoe maak je de beslissing?
De keuze van het type cuvet hangt af van het te gebruiken instrument, de aard van het experiment en het monster zelf. Het is belangrijk dat de cuvetten en cellen zo zijn hoge transmissie mogelijk voor bepaalde gemeten golflengten, dus we beperken het materiaal meestal niet tot alleen het lineaire bereik van de fotometer. Kwarts cuvetten hebben de hoogste transmissie tussen alle materialen.
Figuur 12. Kwartscuvetten met de hoogste transmissie
De vereisten van de apparatuur vereisen dat de cuvet compatibel is met het instrument. De externe grootte van de cuvette, omdat deze in de cuvettehouder moet passen, is van groot belang, en let ook op de hoogte van de meetkamer.
Een andere factor om te overwegen is de positie van de lichtstraal ( Z-afmeting): de lichtbron moet door het optische venster van de cuvetten kunnen gaan. Dit is vooral belangrijk voor cuvetten met een sub-microvolume met zeer kleine openingen. De heldere vensters voor lichtstralen kunnen erg klein zijn (dwz 2 mm x 5 mm). Als het niet goed is gekozen, is het Z-afmeting (lichte hoogte), zijn de microcuvetten mogelijk niet compatibel en kunnen ze niet worden gebruikt. Gangbare Z-afmetingen zijn 8,5 mm, 15 mm en 20 mm.
Figuur 13. Kleine venstercuvetten Z-afmeting van 8,5 15 20 mm
De volgende belangrijke factor is de meting van spectrale golflengten betrokken bij de aanvragen. PMMA-, polystyreen- of optische glazen cuvetten zijn alleen transparant in het zichtbare bereik. Wanneer metingen worden toegepast UV-golflengten van minder dan 300 nm kwartscuvetten of IR kwarts Er moeten cuvetten worden gebruikt die voldoende transmissie hebben.
Figuur 14. Absorptie van cuvetten van kwarts of glas tussen 220 nm en 400 nm
Temperatuurgestuurd van cuvette
Voor die methoden die afhankelijk zijn van reacties op een specifiek temperatuur- en absorptie meting in de tijd, verwarming en efficiënt temperatuurregeling van het monster tijdens het proces is essentieel. In dit geval moet naast voldoende materiaalsterkte ook het contactoppervlak tussen de cuvetwand en de temperatuurgeregelde cuvetschacht zo groot mogelijk zijn. Daarom zijn bij temperatuurgecontroleerde toepassingen bepaalde cuvetten zoals macro cuvetten bieden voordelen.
Andere factoren waarmee u rekening moet houden bij het kiezen van een cuvet zijn de chemische weerstand , het voorbeeld volume en concentratie bij de hand.
Chemische weerstand van de cuvet
Het materiaal waaruit de cuvette is gemaakt, is relatief minder belangrijk als het monster een waterig oplossing. Plastic of glazen of kwartscuvetten werken allemaal en u kunt zelfs kiezen voor de meest betaalbare NRC verlijmde cuvetten.
Als organische oplosmiddelenAan de andere kant hebben glazen en kwartscuvetten de voorkeur omdat deze robuuster zijn in vergelijking met plastic alternatieven. En de NRC zal niet werken met organische oplosmiddelen, in plaats daarvan zou je moeten kiezen voor CRF- of HTR-versies.
Figuur 15. Soorten cuvetten verschillen in chemische resistentie
* HTR : Bestand tegen hoge temperaturen. Hoogste kwaliteit voor geavanceerde experimenten. Dit soort cuvetten wordt gesmolten en uit één stuk vervaardigd, met buitengewone weerstand tegen hoge temperaturen (<1200 ℃) en bijtende chemicaliën. Overdracht is 83% over. Geen gegevensuitlezing variatie is op aanvraag beschikbaar (standaard< 0,3%) voor 2 of meer stuks. HTR-5 betekent dat de cuvette 5 heldere wanden heeft.
- Opmerking: Deze HTR-cuvetten kunnen met de meest populaire worden gebruikt organische oplosmiddelen , net zoals zuren en basen. Ze zijn compatibel met chemicaliën zoals aceton, butanon, DMF en geconcentreerd zoutzuur.
* CRF : Chemisch bestendig gesmolten. BestsellerDit type cuvetten is bestand tegen de meeste organische oplosmiddelen, zuren en basen. Het heeft echter de kans om door sommige chemicaliën aan de lijmranden te worden bevlekt. Het is een goedkoper alternatief voor het HTR-type. CRF-H heeft een hogere transmissie (83% versus 80%) dan CRF en dezelfde transmissie met HTR.
- Opmerking Gebruik de CRF-cuvet niet om chemicaliën voor een lange tijd op te slaan. Maak hem na gebruik schoon.
NRC: Niet bestand tegen chemicaliën. Dit type cuvette wordt met lijm in elkaar gezet.
- Opmerking: Houd er rekening mee dat deze NRC-cuvetten niet mogen worden gebruikt met benzeen, tolueen, aqua regia, ethanol, bijtende oplossingen of andere soortgelijke stoffen, aangezien deze de hechting tussen de stukken kunnen aantasten en ervoor kunnen zorgen dat de cuvet gaat lekken. NIET DOEN Spoel de cuvet om met ethanol of vergelijkbare oplossingen om te reinigen.
Verder lezen: Uitleg over HTR, CRF, NRC en chemische resistentie
Zeer klein monstervolume
Als er maar een paar voorbeelden beschikbaar zijn, is de hergebruik van het monster voor de volgende metingen kunnen worden overwogen. In dit geval wordt het aanbevolen om wegwerp te gebruiken plastic cuvetten. Het risico op besmetting wordt geminimaliseerd als de plastic cuvetten afzonderlijk verpakt zijn en een gepaste zuiverheid hebben.
Alternatief, sub-micro-kwartscuvetten kunnen worden geselecteerd die zijn ontworpen om te gebruiken met extreem volumes van microcuvetten
- Sub-micro- of microvolume-cuvetten kunnen zijn hergebruikt, waardoor de noodzaak om de voorraad verbruikscuvetten voortdurend aan te vullen, wordt geëlimineerd. Het is voor ons mogelijk om kostbare onverdunde monsters terug te winnen voor sommige stroomafwaartse metingen, vooral die waarbij steriliteit geen vereiste is.
Figuur 16. Sub-microcuvetten
Monsterconcentratie en cuvettepadlengte
De monster concentratie beïnvloedt ook de selectie van de cuvet, aangezien elk instrument een bovenste detectie heeft limiet. Een dubbelstrengs DNA kan bijvoorbeeld nauwkeurig worden gekwantificeerd tot een maximale concentratie van 100 μg / ml, bij gebruik van een spectrofotometer met een lineair meetbereik tot 2 A met een 10 mm cuvetpadlengte.
Oplossingen met een hogere concentratie moeten worden verdund, of een cuvet met een kortere padlengte kan worden gebruikt om de verdunning te simuleren. Bekend van de Wet van Beer-Lambert Met een padlengte van 1 mm cuvetten kan de dsDNS-concentratie oplopen tot 1.000 µg / ml.
Uitgebreide lezing: UV-zichtbare spectrofotometeropstelling en wet van Beer-Lambert
Over het algemeen hebben cuvetten van kwarts en glas een hogere transmissie en nauwkeurigheid van spectroscopiemetingen, en deze cuvetten kunnen veel vaker worden hergebruikt. De plastic cuvet is echter goedkoop en gemakkelijk te gebruiken, hoeft niet te worden schoongemaakt en kruisbesmetting te voorkomen, waardoor het een uitstekende keuze is voor proteïne, DNA en RNA en waterige oplossingen.
Dat is alles voor vandaag! Bedankt voor je tijd bij het lezen!
Het iCuvets.Com-team