Înțelegerea volumului, materialului, lungimii traseului etc.
Un spectrofotometru este o alegere ideală pentru măsurarea materialelor de interes luminoase absorbanta sau transmitanță la o lungime de undă specifică a spectrului, în acest mod pentru a obține date despre substanță concentraţie și puritate . O cuvă este un vas mic care conține probe utilizate pentru măsurători spectroscopice care sunt plasate în spectrofotometre. Cuvetele sunt realizate din diverse dimensiuni , volume, și materiale , și ar trebui să fie transparent pentru gama de lungimi de undă vizate.
Pentru măsurătorile fotometrice ale soluțiilor lichide, probele trebuie poziționate în calea optică a luminii unui fotometru (spectrofotometru, fluorometru sau colorimetru) într-un format predefinit. Opțiunea standard pentru această aplicație este cuve, recipiente pentru probe care conțin 2 sau 4 ferestre optice transparente.
Figura 1. Lungimea standard a căii optice a cuvetelor
Există atât de multe tipuri de cuvete disponibile (avem peste 260 de sku-uri de cuvete listate pe site-urile noastre), chiar și atunci când restrângem intervalul numai la cele utilizate pentru măsurători de absorbanță în domeniul spectrofotometriei UV-vis
Diferite scheme cuvete, a - e sunt celule de dimensiuni standard
Soluția eșantion este cazat în interiorul rliniile ed ale cuvetelor de mai sus. Celulele cuvete a - e sunt desenate pentru a avea dimensiuni externe de 12,5 x 12,5 x 45 mm.
- a: cuvă de fluorescență de dimensiuni interioare de 10 x 10 mm;
- b: cuvă semi-fluorescentă de 2 x 10 mm;
- c: cuvă semi-absorbantă de 2 x 10 mm;
- d: 2 x 10 mm cuvă sub-volum;
- e: cuvă de fluorescență de dimensiuni interioare de 2 x 2 mm.
Cuve de fluorescență sunt cuvete care au 4 pereți clari (unele tipuri specializate de cuvete au trei pereți transparenți) în timp ce cuvetele de absorbție sunt de obicei 2 pereți limpezi. Cuvetele f și g sunt exemple de cuve cu dimensiuni standard, care se mai numesc și cuve cu lungime scurtă. Lungimea traseului și dimensiunea externă sunt mai mici decât cuvetele standard.
Lungimea traseului cuvetei este lungimea luminii care traversează cuveta.
Cuvetele a și c au o lungime de traiectorie de 10 mm. Celulele cuvete b, c și f au aceleași dimensiuni interioare (2 x 10 mm), iar cuvetele e și g au aceleași dimensiuni interioare (2 x 2 mm), dar dimensiuni exterioare diferite.
NOTĂ: Dimensiunile exterioare ale cuvetelor f și g nu sunt standard și nu se aplică în această discuție, cu excepția cazului în care sunt menționate în mod specific. Cu toate acestea, cei care se simt confortabil cu cuve non-standard le pot folosi întotdeauna, utilizând adaptoare adecvate sau suporturi pentru probe special concepute.
Cuveta c este o cuvă cu absorbanță semi-volumică (2 pereți clari). Are doi pereți întunecați (negri) pe care nu îi transmite nicio lumină. Acest lucru este util, deoarece o cuvă cu o lungime de traiectorie de 10 mm poate fi utilizată cu un volum mult mai mic și orice lumină care nu trece prin soluție va fi maschată pentru a ajunge la detectorul de lumină.
Este foarte important să nu utilizați cuva b în locul cuvei c într-un experiment de absorbție. Folosind b în măsurarea absorbanței va duce la o citire incorectă chiar și atunci când fundul cuvei b a fost măsurat. Cuveta c, pe de altă parte, nu este potrivită pentru o măsurare a emisiilor, care se efectuează de obicei printr-o geometrie diferită.
Factorii care includ caracteristicile eșantionului, disponibilitatea volumului, nivelurile de concentrație și tipurile de măsurători care trebuie efectuate ar trebui să afecteze decizia atunci când alegeți cuva potrivită pentru aplicațiile dvs.
Figura 2. Diferite tipuri de cuvete
Cuvete după volum
Cuveta cea mai utilizată este de tip pătrat, cu o dimensiune externă de 12,5 x 12,5 mm și o înălțime de 45 mm și o dimensiune internă de 10 x 10 mm. Aceasta este o dimensiune standard pentru care sunt proiectate majoritatea suporturilor de spectrofotometre și fluorometre. Morice tip de cuve mai mari și mai mici sunt, desigur, disponibile. Sunt disponibile, de asemenea, adaptoare care permit cuve cu lungime scurtă mai mică în suportul standard care acceptă cuve pătrate de 12,5 mm x 12,5 mm.
Cu această dimensiune externă, cuvelele sunt disponibile de la< 100 microlitri ( cuve sub-micro ) la câteva sute de microlitri ( cuve semi-micro ) la cuve cu volum standard de 3,5 mililitri. Desigur, un volum mai mare de cuvete (tip macro ) mai mari de 3,5 mL sunt de asemenea disponibile, iar dimensiunea externă va fi mai mare.
Figura 3. Cuvetele diferă în volum cu aceeași amprentă
Cum se determină Volumul Cuvette?
Volumul cuvetei se referă, de asemenea, la volumul de lichid eșantion pe care sunt proiectate să îl păstreze.
O cuvă pătrată de 1 cm găzduiește 1 ml de lichid pe 1 cm de înălțime. Prin urmare, o cuvă de 43,75 mm înălțime (45 mm - 1,25 mm grosime de bază) poate conține până la 4,375 ml de lichid. Dacă cuva este plină 80%, atunci volumul total va fi de 3,5 ml, ceea ce este așa-numitul volum standard .
4,375 ml x 80% = 3,5 ml
Motivul pentru care 80% este că nu trebuie să umpleți cuva niciodată mai mult de 80%. Când lichidele sunt prea aproape de marginea celulei (> 80%), s-ar putea vărsa cu ușurință și vor cauza multe probleme în timpul măsurătorilor.
Care sunt opțiunile de volum Cuvette?
Patru tipuri de opțiuni de volum sunt disponibile atunci când alegeți o cuvă:
- Volumul de măsurare al unui macro cuva este mai mare de 3,5 mL (7 - 35 mL).
- O cuvă cu volum standard conține un volum de măsurare de 3,5 ml.
- Un volum de microcuvetă conține probe de 0,35 ml - 1,7 ml. Dintre aceste tipuri de cuve cu lungime scurtă a traseului pot fi necesare cuve monturi sau distanțiere .
- O cuvă sub-mic volum conține probe între 20 uL și 350 uL.
Figura 5. Cuvete standard de 3,5 ml
Care este Alegerea cuvetelor cu micro volum pentru probe limitate?
Pentru multe măsurători biologice, probele sunt atât de valoroase, iar câțiva mililitri din volum sunt dificil de vizat. Volumul necesar poate fi micșorat prin îngroșarea a două sau patru laturi ale cuvetei în interiorul pereților.
De exemplu, o cuvă de 4 mm este o cuvă cu o dimensiune externă de 12,5 mm x 12,5 mm și o dimensiune interioară de 4 mm x 10 mm. O astfel de cuvă de 4 mm va necesita un volum de lichid de 1,4 ml pe - 45 mm înălțime; în mod similar, o cuvă de 1 mm corespunde unui volum de lichid de 0,35 ml pe - 45 mm înălțimea cuvei.
Vezi exemplele de mai jos:
Figura 6. Semi Micro Cuvete cu baze pătrate de 12,5 * 12,5 mm
Figura 7. Montați și distanțați permițând cuvete de lungime scurtă a căii în suportul standard
Spectrofotometrele și fluorometrele efectuează măsurători la unul din cele trei fascicule optice standard Z dimensiuni (distanța de la fundul cuvei până la centrul diafragmei de măsurare) - fie 8,5, 15 sau 20 mm - în funcție de instrumentul specific.
Cuve standard sunt de obicei cu pereți drepți și se vor potrivi în majoritatea spectrofotometrelor. Pe de altă parte, semi microcuvete au aceeași amprentă exterioară, dar interiorul lor este de obicei conic la o cantitate limitată de eșantion. Indiferent, sub microcuvetă este conceput pentru a măsura prin eșantion la o dimensiune Z specifică în cameră. Este important să vă asigurați că cuveta pe care o selectați pentru măsurătorile de probă este compatibilă cu înălțimea dimensiunii Z a instrumentului dumneavoastră.
Figura 8. Cuvetele de sub micro volum diferă în dimensiunile Z.
Cuveta după lungimea căii
Într-un laborator tipic de cercetare, spectrofotometrul are o dimensiune standard a camerei în care este cazată o cuvă pentru a permite o lungime de undă a luminii specifice care trece prin soluția de probă. Această distanță între fereastra optică paralelă a cuvei este fabricată cu precizie și este cunoscută în prealabil, ceea ce este cunoscut sub numele de lungimea traseului cuvei .
Figura 9. Lungimea căii cuvetei
lungimea căii standard a unei cuve este de 10 mm, cu toate acestea, a lungimea traseului mai mică și lungime mai mare a drumului este, de asemenea, disponibil listat în stoc. Cuvetele cu traiectorie mai scurtă au de obicei un volum mai mic, iar lungimea mai lungă a traiectoriei cuvei face volumul mai mare.
Iată câteva caracteristici importante ale cuvei de luat în considerare:
- Atunci când se efectuează măsurători de probe care se găsesc la concentrații scăzute - de exemplu, ARN, ADN monocatenar și oligonucleotide - se recomandă o lungime a căii suficient de mare pentru ca citirile datelor să se încadreze în domeniul de măsurare liniar al instrumentului. Dimensiunea standard este de 10 mm lungime a traseului, vestea bună este că cuve cu o lungime opțională a traseului sunt acum disponibile la noi (lungimea căii duale ).
Figura 10. Cuvetă de 10 mm care poate fi rotită cu 90 de grade pentru a permite citirea la o lungime a căii de 2/5 mm
Figura 11. Cuvete și montură de lungime scurtă a căii
Cuveta după Materiale
Cuvetele din diferite materiale se pot încadra în diferite game spectrale. Este important să vă asigurați că cuva selectată este transparentă la lungimile de undă specifice atunci când măsurați probele de interes. O alegere ideală a materialului cuvei ar găzdui, de asemenea, numai probe (în principal soluții lichide) și nu interacționează cu probele utilizate în măsurare.
Cuvetele au o transmisie de lumină a interval de lungimi de undă limitat , si are refractiv nepotrivire dielectrică a indexului (diferit indice de refracție al aerului și soluțiilor), și poate avea daune precum zgârieturile care pot fi foarte mici și neobservate. Toți acești factori pot afecta măsurarea rezultatului experimentului.
Lungimile de undă ale cuvei de utilizat sunt determinate de materialul cuvei. O transmisie suficientă este importantă pentru cuvetă, astfel încât atenuarea luminii către pereții transparenți ai celulei să nu aibă un efect negativ asupra rezultatului măsurării.
Transmisia pentru toate lungimile de undă este nu uniformă pentru cuve optice standard și cel mai frecvent transmisia spectrală în UV sau IR este domeniul limitativ. Gama vizibilă este transmisă în mod obișnuit de aproape toate tipurile de materiale ale cuvei.
Cu toate acestea, există NICI un acord universal a transmisiei minime necesare pentru un anumit interval de lungimi de undă. Și diferite standarde sunt aplicate de diferiți producători (variază între 10% și 90%).
Gama de transmisie utilizabilă din diferite materiale
Acest tabel nu trebuie luat sau folosit ca referință literal. Este folosit doar pentru a permite cititorului să înțeleagă că gama utilizabilă de cuvete va varia considerabil. Este important să vă asigurați că cuva care va fi utilizată va funcționa sub lungimea de undă de interes.
Material cuarț are cea mai mare rezistență la transmisie și temperatură, cel mai important este transparent atât în lumina vizibilă, cât și în domeniul UV și este o alegere adecvată atunci când se măsoară probele în spectrul luminii UV.
Sticlă și plastic materialele sunt în mod normal transparente la lumina vizibilă (380-700 nm), dar absorb în UV (190 - 340 nm) intervalele de lungimi de undă. Prin urmare, cuvetele din sticlă și plastic sunt ideale pentru testele colorimetrice ale proteinelor sau pentru măsurarea densității culturilor bacteriene, care nu poti să fie utilizat pentru măsurarea concentrației și a purității probelor în intervalele UV. Cuve din plastic sunt ieftine și de unică folosință.
Cuve din plastic care funcționează sub 380 nm sunt disponibile, dar restul cuvelelor din plastic transparente majoritare sunt disponibile nu sunt adecvate pentru experimente de fluorescență sau absorbție.
De fapt, procesul de fabricație (calitatea suprafeței și puritatea peretelui) duce la atenuarea luminii (rata de absorbție). Prin urmare, performanța cuvei poate diferi de la o marcă la alta. În plus, mulți producători își folosesc propriile materiale proprii și acoperirea suprafeței pentru a-și mări gama de transmisie și / sau a reduce costurile cuvei.
Notă: Poate fi necesară o transmisie ridicată pentru a produce rezultate semnificative și de încredere, care pot provoca probleme la marginile domeniilor de transmisie a cuvetei.
Există avantaje și dezavantaje la tipurile de cuvete. Iată câteva sfaturi suplimentare pentru a vă ghida la selectarea cuvetei mai potrivite pentru măsurători de probă cu precizie și fiabilitate.
Cum se ia decizia?
Alegerea tipului de cuvetă depinde de instrumentul de utilizat, de natura experimentului și de proba în sine. Este important ca cuvetele și celulele să aibă ca transmisie mare pe cât posibil pentru anumite lungimi de undă măsurate, deci nu limităm materialul doar la domeniul liniar al fotometrului. Cuve de cuarț au cea mai mare transmisie dintre toate materialele.
Figura 12. Cuvete de cuarț cu cea mai mare transmisie
Cerințele echipamentului necesită compatibilitatea cuvei cu instrumentul. dimensiunea externă Cuveta, deoarece trebuie să se încadreze în suportul cuvei, are o importanță majoră și, de asemenea, luați notă de înălţime a camerei de măsurare.
Un alt factor de luat în considerare este poziția fasciculului luminos ( Dimensiunea Z): sursa de lumină trebuie să poată trece prin fereastra optică a cuvetelor. Acest lucru este deosebit de important pentru cuvetele cu sub-mic volum care au deschideri foarte mici. Ferestrele clare pentru grinzile de lumină ar putea fi foarte mici (adică 2 mm x 5 mm). Dacă nu este ales corect Dimensiunea Z (înălțime ușoară), microcuvetele s-ar putea să nu fie compatibile și să nu poată fi utilizate. Dimensiunile comune Z sunt 8,5 mm, 15 mm și 20 mm.
Figura 13. Cuvete ferestre mici dimensiunea Z de 8,5 15 20 mm
Următorul factor major este măsurarea lungimi de undă spectrale implicat în aplicații. Cuve PMMA, polistiren sau sticlă optică sunt transparente numai în intervalul vizibil. Când măsurătorile aplică lungimi de undă UV de mai puțin de 300 nm , cuve de cuarț sau Cuarț IR ar trebui folosite cuve care au o transmisie suficientă.
Figura 14. Absorbanta cuvetelor din cuarț sau material din sticlă între 220 nm și 400 nm
Temperatura controlată a cuvetei
Pentru acele metode care se bazează pe reacții la un anumit temperatura și absorbanta măsurare în timp, încălzire și eficiență controlul temperaturii a eșantionului în timpul procesului este esențială. În acest caz, zona de contact dintre peretele cuvetei și arborele cuvei cu temperatură controlată ar trebui să fie, de asemenea, cât mai mare posibil, în plus față de rezistența materială adecvată. Prin urmare, în aplicații cu temperatură controlată, anumite cuve precum cuve macro ofera avantaje.
Alți factori de luat în considerare atunci când alegeți o cuvetă includ rezistență chimică , proba volum și concentraţie la mana.
Rezistența chimică a cuvetei
Materialul din care este produsă cuva este relativ mai puțin important atunci când proba este un apos soluţie. Cuve din plastic sau sticlă sau cuarț vor funcționa și puteți alege chiar și cele mai accesibile cuve NRC lipite.
Dacă solventi organicipe de altă parte, sunt implicate, cuvetele din sticlă și cuarț sunt alegerea preferată, deoarece acestea sunt mai robuste în comparație cu alternativele din plastic. Și NRC nu va funcționa cu solvenți organici, în schimb, ar trebui să mergeți cu versiunile CRF sau HTR.
Figura 15. Tipurile de cuvete diferă în ceea ce privește rezistența chimică
* HTR : Rezistent la temperaturi ridicate. Cea mai bună calitate pentru experimente avansate. Aceste tipuri de cuvete sunt topite și fabricate ca o singură bucată, cu o rezistență extraordinară la temperaturi ridicate (<1200 ℃) și substanțe chimice corozive. Transmiterea este 83% peste. Citire zero a datelor varianta este disponibilă la cerere (implicit< 0,3%) pentru 2 sau mai multe piese. HTR-5 înseamnă că cuva are 5 pereți clari.
- Notă: Aceste cuve HTR pot fi utilizate cu cele mai populare solventi organici , precum și acizi și baze. Sunt compatibile cu substanțe chimice precum acetonă, butanonă, DMF și acid clorhidric concentrat.
* CRF : Fuzionat rezistent la substanțe chimice. Cel mai vândut! Acest tip de cuve este rezistent la majoritatea solvenților organici, acizilor și bazelor. Cu toate acestea, are șansa de a fi colorat de unele substanțe chimice pe marginile de legătură. Este o alternativă mai ieftină la tipul HTR. CRF-H are o transmisie mai mare (83% vs 80%) decât CRF și aceeași transmisie cu HTR.
- Notă : vă rugăm să nu utilizați cuva CRF pentru a depozita produse chimice pentru o lungă perioadă de timp. Curățați-l după utilizare.
* NRC: Nu este rezistent la substanțe chimice. Acest tip de cuvetă este asamblat cu adeziv.
- Notă: Vă rugăm să rețineți că aceste cuvete NRC nu trebuie utilizate cu benzen, toluen, aqua regia, etanol, soluții corozive sau alte substanțe similare, deoarece acestea pot degrada legăturile dintre bucăți și pot provoca scurgerea cuvetei. NU FACE clătiți cuveta cu etanol sau soluții similare pentru curățare.
Lecturi suplimentare: Explicația HTR, CRF, NRC și rezistența chimică
Volum eșantion foarte mic
Dacă sunt disponibile doar câteva mostre, refolosirea a probei pentru următoarele măsurători poate fi luată în considerare. În acest caz, se recomandă utilizarea de unică folosință cuve din plastic. Riscul de contaminare va fi minimizat dacă cuvele de plastic sunt ambalate individual și au o calitate de puritate adecvată.
Alternativ, sub cuve de cuarț sub pot fi selectate care au fost concepute pentru a fi utilizate cu extrem volume de microcuvetă .
- Cuvete sub micro sau microvolume pot fi reutilizat, eliminând necesitatea alimentării continue a stocului de cuve consumabile. Este posibil pentru noi să recuperăm probe prețioase nediluate pentru unele măsurători din aval, în special cele în care sterilitatea nu este o cerință obligatorie.
Figura 16. Sub Micro Cuvete
Concentrația probei și lungimea căii cuvetei
concentrația probei influențează, de asemenea, selectarea cuvetei, deoarece fiecare instrument are o detecție superioară limită. De exemplu, un ADN dublu catenar poate fi cuantificat cu precizie până la concentrația maximă de 100 μg / ml, atunci când se utilizează un spectrofotometru cu un domeniu liniar de măsurare de până la 2 A cu o lungime a traiectoriei cuvetei de 10 mm.
Soluțiile cu concentrație mai mare trebuie fie diluate, fie o cuvă cu lungimea traseului mai mică poate fi folosit pentru a simula diluarea. Cunoscut din Legea Beer-Lambert , O lungime a căii de 1 mm cuve va permite concentrația dsDNS să fie de până la 1.000 µg / mL.
Lectură extinsă: Configurarea spectrofotometrului vizibil UV și Legea Beer-Lambert
În general vorbind, cuvele de cuarț și sticlă au o transmisie și o precizie mai mari a măsurătorilor spectroscopice, iar aceste cuve pot fi refolosite de mai multe ori. Cuveta din plastic este însă ieftină și ușor de utilizat, nu este nevoie să curățați și să evitați contaminarea încrucișată, ceea ce o face o alegere excelentă pentru proteine, ADN și ARN și soluții apoase.
Asta e tot pentru astăzi! Vă mulțumim pentru timpul petrecut la citire!
Echipa iCuvets.Com
