Comprensione del volume della cuvetta, del materiale, della lunghezza del percorso, ecc.
Uno spettrofotometro è la scelta ideale per misurare i materiali di interesse luce assorbanza o trasmissione ad una specifica lunghezza d’onda dello spettro, in questo modo per ottenere dati sulla sostanza concentrazione e purezza . Una cuvetta è un piccolo recipiente contenente campioni utilizzati per misurazioni spettroscopiche che vengono inseriti negli spettrofotometri. Le cuvette sono fatte di vari dimensioni , volumi, e materiali , e dovrebbe essere trasparente per l’intervallo di lunghezze d’onda mirato.
Tipi di cuvette
Per le misurazioni fotometriche di soluzioni liquide, i campioni devono essere posizionati nel percorso ottico della luce di un fotometro (spettrofotometro, fluorometro o colorimetro) in un formato predefinito. L’opzione standard per questa applicazione è cuvette, contenitori di campioni contenenti 2 o 4 finestre trasparenti ottiche.
Figura 1. Lunghezza del percorso ottico standard delle cuvette
Sono disponibili così tanti tipi di cuvette (abbiamo oltre 260 sku di cuvette elencate sui nostri siti), anche quando si restringe l’intervallo solo a quelle utilizzate per le misurazioni dell’assorbanza nel campo della spettrofotometria UV-vis.
Diversi schemi di cuvette, a – e sono celle di dimensioni standard
La soluzione di esempio è accomodato all’interno della rlinee delle cuvette sopra. Le celle della cuvetta a – e sono disegnate per avere dimensioni esterne di 12,5 x 12,5 x 45 mm.
- a: cuvetta per fluorescenza di dimensione interna 10 x 10 mm;
- b: cuvetta semi micro fluorescente 2 x 10 mm;
- c: cuvette semi micro assorbimento 2 x 10 mm;
- d: cuvette sub micro volume 2 x 10 mm;
- e: cuvetta per fluorescenza da 2 x 2 mm di dimensione interna.
Le cuvette a fluorescenza sono cuvette che hanno 4 pareti trasparenti (alcuni tipi specializzati di cuvette hanno tre pareti trasparenti) mentre le cuvette ad assorbimento sono generalmente 2 pareti trasparenti. Le cuvette feg sono esempi di cuvette di dimensioni non standard, chiamate anche cuvette con percorso breve. La lunghezza del percorso e le dimensioni esterne sono inferiori rispetto alle cuvette standard.
La lunghezza del percorso della cuvetta è la lunghezza della luce che attraversa la cuvetta.
Le cuvette a e c hanno una lunghezza del percorso di 10 mm. Le cuvette b, c ed f hanno le stesse dimensioni interne (2 x 10 mm) e le cuvette eeg hanno le stesse dimensioni interne (2 x 2 mm) ma differenti dimensioni esterne.
NOTA: Le dimensioni esterne delle cuvette f e g non sono standard e non sono applicabili in questa discussione a meno che non vi si faccia riferimento specificamente. Tuttavia, chi è a proprio agio con cuvette non standard può sempre utilizzarle, utilizzando adattatori o portacampioni appositamente progettati.
La cuvetta c è una cuvetta ad assorbanza semi micro volumetrica (2 pareti trasparenti). Ha due pareti scure (nere) che nessuna luce trasmette. Ciò è utile perché una cuvetta di 10 mm di lunghezza del percorso può essere utilizzata con un volume molto più piccolo e qualsiasi luce che non passa attraverso la soluzione verrà mascherata dal raggiungere il rilevatore di luce.
È molto importante non utilizzare la cuvetta b invece della cuvetta c in un esperimento di assorbanza. L’uso di b nella misurazione dell’assorbanza porterà a una lettura errata anche quando è stato misurato lo sfondo della cuvetta b. La cuvetta c, d’altra parte, non è adatta per una misurazione delle emissioni, che di solito viene eseguita da una geometria diversa.
I fattori tra cui le caratteristiche del campione, la disponibilità del volume, i livelli di concentrazione e i tipi di misurazioni da effettuare dovrebbero influenzare la decisione quando si sceglie la cuvetta appropriata per le proprie applicazioni.
Figura 2. Diversi tipi di cuvette
Cuvette in base al volume
La cuvetta più utilizzata è di tipo quadrato con una dimensione esterna di 12,5 x 12,5 mm e un’altezza di 45 mm e una dimensione interna di 10 x 10 mm. Questa è una dimensione standard per la quale sono progettati la maggior parte degli spettrofotometri e dei supporti per fluorometri. MNaturalmente sono disponibili anche tutti i tipi di cuvette più grandi e più piccole. Sono disponibili anche adattatori che consentono di inserire cuvette con percorso corto più piccolo nel supporto standard che accetta cuvette quadrate da 12,5 mm x 12,5 mm.
Con questa dimensione esterna, le cuvette sono disponibili da< 100 microlitri ( cuvette sub-micro ) a poche centinaia di microlitri ( cuvette semimicro ) per cuvette a volume standard di 3,5 millilitri. Ovviamente, un volume maggiore di cuvette (tipo di macro ) è disponibile anche maggiore di 3,5 ml e la dimensione esterna sarà maggiore.
Figura 3. Le cuvette differiscono in volume con la stessa impronta
Come viene determinato il volume della cuvetta?
Il volume della cuvetta si riferisce anche al volume del liquido campione che devono contenere.
Una cuvetta quadrata da 1 cm contiene 1 mL di liquido per 1 cm di altezza. Pertanto, una cuvetta di 43,75 mm di altezza (45 mm – 1,25 mm di spessore della base) può contenere fino a 4,375 ml di liquido. Se la cuvetta è piena all’80%, il volume totale sarà di 3,5 mL, che è il cosiddetto volume standard .
4,375 mL x 80% = 3,5 mL
Il motivo per l’80% è che non si dovrebbe mai riempire la cuvetta più dell’80%. Quando i liquidi sono troppo vicini al bordo della cella (> 80%), potrebbero facilmente fuoriuscire e causare molti problemi durante le misurazioni.
Quali sono le opzioni del volume della cuvetta?
Quando si sceglie una cuvetta sono disponibili quattro tipi di opzioni di volume:
- Il volume di misurazione di a macro la cuvetta è maggiore di 3,5 mL (7-35 mL).
- Una cuvetta del volume standard contiene un volume di misurazione di 3,5 mL.
- Un volume di cuvetta semi micro contiene campioni di 0,35 ml – 1,7 ml. Tra questi tipi di cuvette con percorso breve può essere necessaria una cuvetta monta o distanziatori .
- Una cuvetta sub micro volume contiene campioni tra 20 ul e 350 ul.
Figura 4. Cuvette Macro
Figura 5. Cuvette standard da 3,5 ml
Qual è il file Scelta di cuvette micro volume per campioni limitati?
Per molte misurazioni biologiche, i campioni sono così preziosi e alcuni millilitri del volume sono difficili da individuare. Il volume richiesto può essere ridotto aumentando lo spessore di due o quattro lati della cuvetta all’interno delle pareti.
Ad esempio, una cuvetta da 4 mm è una cuvetta con una dimensione esterna di 12,5 mm x 12,5 mm e una dimensione interna di 4 mm x 10 mm. Una tale cuvetta da 4 mm richiederà un volume di liquido di 1,4 mL per – 45 mm di altezza; allo stesso modo, una cuvetta da 1 mm corrisponde a un volume di liquido di 0,35 mL per – 45 mm di altezza della cuvetta.
Guarda gli esempi di seguito:
Figura 6. Cuvette semi micro con basi quadrate da 12,5 * 12,5 mm
Figura 7. Montaggio e spaziatore che abilitano le cuvette a percorso breve nel supporto standard
Spettrofotometri e fluorometri effettuano misurazioni su uno dei tre raggi ottici standard Dimensioni Z (la distanza dal fondo della cuvetta al centro dell’apertura di misurazione) — 8,5, 15 o 20 mm — a seconda dello strumento specifico.
Cuvette standard sono generalmente a parete diritta e si adattano alla maggior parte degli spettrofotometri. D’altro canto, cuvette semi micro hanno la stessa impronta esterna, ma il loro interno è tipicamente rastremato a una quantità di campione limitata. Indipendentemente da ciò, il cuvetta sub micro è progettato per misurare attraverso il campione in una dimensione Z specifica nella camera. È importante assicurarsi che la cuvetta selezionata per le misurazioni del campione sia compatibile con l’altezza della dimensione Z del proprio strumento.
Figura 8. Le cuvette sub micro volume differiscono nelle dimensioni Z.
Cuvette in base alla lunghezza del percorso
In un tipico laboratorio di ricerca, lo spettrofotometro ha una camera di dimensioni standard in cui è alloggiata una cuvetta per consentire a una specifica lunghezza d’onda della luce di passare attraverso la soluzione del campione. Questa distanza tra le finestre ottiche parallele della cuvetta è accuratamente prodotta e pre-nota, nota come lunghezza del percorso della cuvetta .
Figura 9. Lunghezza percorso cuvette
Il lunghezza del percorso standard di una cuvetta è di 10 mm, tuttavia, a lunghezza del percorso più breve e lunghezza del percorso più lunga è anche disponibile elencato in magazzino. Lunghezze del percorso più brevi Le cuvette hanno generalmente un volume più piccolo e una lunghezza del percorso della cuvetta più lunga aumenta il volume della cuvetta.
Di seguito sono riportate alcune importanti caratteristiche delle cuvette da considerare:
- Quando si effettuano misurazioni di campioni che si trovano a basse concentrazioni, ad esempio RNA, DNA a filamento singolo e oligonucleotidi, si consiglia una lunghezza del percorso sufficientemente lunga affinché le letture dei dati rientrino nell’intervallo di misurazione lineare dello strumento. La dimensione standard è di 10 mm di lunghezza del percorso, la buona notizia è che le cuvette con una lunghezza del percorso opzionale sono ora disponibili con noi (doppia lunghezza del percorso ).
Figura 10. Cuvetta da 10 mm che può essere ruotata di 90 gradi per consentire una lettura a una lunghezza del percorso di 2/5 mm
- Misurare un campione di piccolo volume su un percorso breve è più facile e veloce che eseguire più passaggi per diluire un campione. Inoltre, poiché ci sono meno passaggi di trasferimento del pipettaggio, è molto probabile che le letture siano più affidabili e accurate.
- Le cuvette semi micro volume con una lunghezza del percorso più breve possono funzionare con distanziatori o supporti per cuvette. Questi risultati di test con cuvette a percorso breve sono più accurati e affidabili quando si misurano campioni concentrati come acidi nucleici o proteine rispetto alla diluizione di preparazioni di campioni.
Figura 11. Cuvette e montaggio a percorso breve
Cuvette per materiali
Le cuvette realizzate con materiali diversi possono adattarsi a diversi intervalli spettrali. È importante assicurarsi che la cuvetta selezionata sia trasparente alle lunghezze d’onda specifiche durante la misurazione dei campioni di interesse. Una scelta ideale di materiale per cuvette potrebbe anche accogliere solo campioni (principalmente soluzioni liquide) e non interagisce con i campioni utilizzato nella misurazione.
Le cuvette hanno una trasmissione della luce di a gamma di lunghezze d’onda limitata , e avere rifrangente disadattamento dielettrico indice (diverso indice di rifrazione di aria e soluzioni), e può avere danni come graffi che possono essere molto piccoli e inosservati. Tutti questi fattori potrebbero influenzare la misurazione dell’esperimento dei risultati.
Le lunghezze d’onda della cuvetta da utilizzare sono determinate dal materiale della cuvetta. Una trasmissione sufficiente è importante per la cuvetta in modo che l’attenuazione della luce sulle pareti trasparenti della cella non abbia un effetto negativo sul risultato della misurazione.
La trasmissione per tutte le lunghezze d’onda è non uniforme per cuvette ottiche standard e più comunemente la trasmissione spettrale in UV o IR è l’intervallo limite. L’intervallo visibile è comunemente trasmesso da quasi tutti i tipi di materiale per cuvette.
Tuttavia, c’è NESSUN accordo universale della trasmissione minima richiesta per uno specifico intervallo di lunghezze d’onda. E standard diversi vengono applicati da diversi produttori (varia tra il 10% e il 90%).
Gamma di trasmissione utilizzabile di materiale diverso
| Materiale | Gamma di trasmissione |
| Quarzo lontano UV | 170-2700 nm |
| Vicino al quarzo IR | 250-3500 nm |
| Quarzo UV | 220-2500 nm |
| Vetro ottico | 340-2500 nm |
| Plastica | 380-850 nm |
| Plastica UV | 220-900 nm |
Questa tabella non deve essere presa o utilizzata come riferimento letteralmente. Viene utilizzato solo per far capire al lettore che la gamma utilizzabile di cuvette varierà notevolmente. È importante assicurarsi che la cuvetta da utilizzare funzioni nell’intervallo di lunghezze d’onda di interesse.
Materiale al quarzo ha la più alta trasmissione e resistenza alla temperatura, soprattutto è trasparente sia nella gamma di luce visibile che UV ed è una scelta appropriata quando si misurano campioni nello spettro della luce UV.
Bicchiere e plastica i materiali sono normalmente trasparenti alla luce visibile (380-700 nm) ma assorbono nei raggi UV (190-340 nm) intervalli di lunghezza d’onda. Pertanto, le cuvette in vetro e plastica sono ideali per i test proteici colorimetrici o la misurazione della densità della coltura batterica, che non può essere utilizzato per misurazioni di concentrazione e purezza di campioni negli intervalli UV. Le cuvette in plastica sono a basso costo e usa e getta.
Sono disponibili cuvette in plastica che funzionano sotto 380 nm, ma il resto delle cuvette in plastica trasparenti lo è non adatto per esperimenti di fluorescenza o assorbimento.
Infatti, il processo di fabbricazione (qualità della superficie e purezza della parete) porta ad un’attenuazione della luce (il tasso di assorbimento). Pertanto, le prestazioni delle cuvette possono variare a seconda dei marchi. Inoltre, molti produttori utilizzano i propri materiali proprietari e il rivestimento superficiale per aumentare il raggio di trasmissione e / o ridurre i costi delle cuvette.
Nota: Potrebbe essere necessaria una trasmissione elevata per produrre risultati significativi e affidabili, che potrebbero causare problemi ai margini degli intervalli di trasmissione della cuvetta.
Ci sono vantaggi e svantaggi per i tipi di cuvette. Di seguito sono riportati altri suggerimenti per guidare l’utente nella selezione della cuvetta più appropriata per misurazioni dei campioni accurate e affidabili.
Come prendere la decisione?
La scelta del tipo di cuvetta dipende dallo strumento da utilizzare, dalla natura dell’esperimento e dal campione stesso. È importante che le cuvette e le celle abbiano come alta trasmissione possibile per determinate lunghezze d’onda misurate, quindi di solito non limitiamo il materiale solo all’intervallo lineare del fotometro. Cuvette al quarzo hanno la più alta trasmissione tra tutti i materiali.
Figura 12. Cuvette al quarzo con la massima trasmissione
I requisiti dell’apparecchiatura richiedono che la cuvetta sia compatibile con lo strumento. Il dimensione esterna della cuvetta, perché deve entrare nel porta cuvette, è di grande importanza e prendere nota anche del altezza della camera di misura.
Un altro fattore da considerare è la posizione del fascio luminoso ( Dimensione Z): la sorgente luminosa deve poter passare attraverso la finestra ottica delle cuvette. Ciò è particolarmente importante per cuvette sub-micro volume che hanno aperture molto piccole. Le finestre trasparenti per i fasci di luce potrebbero essere molto piccole (cioè 2 mm x 5 mm). Se non scelto correttamente, il file Dimensione Z (altezza leggera), le micro cuvette potrebbero non essere compatibili e non possono essere utilizzate. Le dimensioni Z comuni sono 8,5 mm, 15 mm e 20 mm.
Figura 13. Cuvette a finestra piccola dimensione Z di 8,5 15 20 mm
Il prossimo fattore importante è la misurazione di lunghezze d’onda spettrali coinvolti nelle applicazioni. Le cuvette in PMMA, polistirolo o vetro ottico sono trasparenti solo nel campo visibile. Quando le misurazioni applicano lunghezze d’onda UV di inferiore a 300 nm , cuvette in quarzo o Quarzo IR Utilizzare cuvette con trasmissione sufficiente.
Figura 14. Assorbanza delle cuvette in quarzo o materiale di vetro Tra 220 nm e 400 nm
Controllo della temperatura della cuvetta
Per quei metodi che si basano su reazioni in uno specifico temperatura e assorbanza misurazione nel tempo, riscaldamento ed efficienza controllo della temperatura del campione durante il processo è essenziale. In questo caso, anche l’area di contatto tra la parete della cuvetta e il vano della cuvetta a temperatura controllata dovrebbe essere la più grande possibile oltre a un’adeguata resistenza del materiale. Pertanto, nelle applicazioni a temperatura controllata, alcune cuvette come cuvette macro offrire vantaggi.
Altri fattori da considerare quando si sceglie una cuvetta includono il resistenza chimica , il campione volume e concentrazione a mano.
Resistenza chimica della cuvetta
Il materiale da cui viene prodotta la cuvetta è relativamente meno importante quando il campione è un acquoso soluzione. Le cuvette in plastica, vetro o quarzo funzioneranno tutte e puoi persino scegliere le cuvette incollate NRC più convenienti.
Se solventi organiciD’altra parte, sono coinvolti, le cuvette in vetro e quarzo sono la scelta preferita perché sono più robuste rispetto alle alternative in plastica. E l’NRC non funzionerà con solventi organici, invece, dovresti andare con le versioni CRF o HTR.
Figura 15. I tipi di cuvette differiscono per resistenza chimica
* HTR : Resistente alle alte temperature. La più alta qualità per esperimenti avanzati. Questi tipi di cuvette sono fusi e fabbricati come un unico pezzo, con una straordinaria resistenza alle alte temperature (<1200 ℃) e prodotti chimici corrosivi. La trasmissione è 83% al di sopra di. Zero lettura dei dati la variazione è disponibile su richiesta (default< 0,3%) per 2 o più pezzi. HTR-5 significa che la cuvetta ha 5 pareti trasparenti.
- Nota: Queste cuvette HTR possono essere utilizzate con i più diffusi solventi organici , così come acidi e basi. Sono compatibili con sostanze chimiche come acetone, butanone, DMF e acido cloridrico concentrato.
* CRF : Resistente ai prodotti chimici fuso. Il più venduto! Questo tipo di cuvette è resistente alla maggior parte dei solventi organici, acidi e basi. Tuttavia, ha la possibilità di essere macchiato da alcune sostanze chimiche sui bordi di incollaggio. È un’alternativa più economica al tipo HTR. CRF-H ha una trasmissione maggiore (83% vs 80%) rispetto a CRF e la stessa trasmissione con HTR.
- Nota : si prega di non utilizzare la cuvetta CRF per conservare sostanze chimiche per lungo tempo. Puliscilo dopo l’uso.
* NRC: Non resistente ai prodotti chimici. Questo tipo di cuvette è assemblato con la colla.
- Nota: Si noti che queste cuvette NRC non devono essere utilizzate con benzene, toluene, acqua regia, etanolo, soluzioni corrosive o altre sostanze simili, poiché potrebbero degradare i legami tra i pezzi e causare perdite dalla cuvetta. NON sciacquare la cuvetta con etanolo o soluzioni simili per la pulizia.
Ulteriore lettura: Spiegazione di HTR, CRF, NRC e resistenza chimica
Volume di campione molto piccolo
Se sono disponibili solo pochi campioni, il file riutilizzo del campione per le seguenti misurazioni può essere considerato. In questo caso, si consiglia di utilizzare usa e getta cuvette di plastica. Il rischio di contaminazione sarà ridotto al minimo se le cuvette di plastica sono confezionate singolarmente e hanno una qualità di purezza adeguata.
In alternativa, cuvette sub micro quarzo possono essere selezionati che sono stati progettati per l’uso con estremamente volumi della micro cuvetta .
- Le cuvette sub micro o microvolume possono essere riutilizzato, eliminando la necessità di rifornire continuamente la scorta di cuvette consumabili. È possibile per noi recuperare preziosi campioni non diluiti per alcune misurazioni a valle, soprattutto quelle in cui la sterilità non è un requisito obbligatorio.
Figura 16. Cuvette sub micro
Concentrazione del campione e lunghezza del percorso della cuvetta
Il concentrazione del campione influenza anche la selezione della cuvetta poiché ogni strumento ha un rilevamento superiore limite. Ad esempio, un DNA a doppia elica può essere quantificato con precisione fino a una concentrazione massima di 100 μg / ml, quando si utilizza uno spettrofotometro con un intervallo di misurazione lineare fino a 2 A con una lunghezza del percorso della cuvetta di 10 mm.
Le soluzioni a concentrazione più elevata devono essere diluite o una cuvetta con a lunghezza del percorso più breve può essere utilizzato per simulare la diluizione. Conosciuto dal Legge di Beer-Lambert , Una lunghezza del percorso di cuvette da 1 mm consentirà alla concentrazione di dsDNS di raggiungere 1.000 µg / mL.
Lettura estesa: Configurazione dello spettrofotometro UV visibile e legge di Beer-Lambert
In generale, le cuvette in quarzo e vetro hanno una trasmissione e un’accuratezza maggiori delle misurazioni spettroscopiche e queste cuvette possono essere riutilizzate molte più volte. Tuttavia, la cuvetta in plastica è economica e facile da usare, non è necessario pulire ed evitare la contaminazione incrociata, il che la rende una scelta eccellente per proteine, DNA e RNA e soluzioni acquose.
È tutto per oggi! Grazie per il tuo tempo a leggere!
Il team di iCuvets.Com